آزمون سمیت شناسی به روش MTT

آزمون سمیت شناسی به روش MTT

رایج ترین روش برای اندازه گیری سمیت داروها و تخمین میزان IC50، استفاده از محلول رنگی تریپان بلو و سنجش با لام هموسایتومتر می باشد. ولی امروزه روش های دقیقتری مانند روش های MTT برای سنجش سمیت داروها و به خصوص نانوذرات استفاده می شود.

معرفی MTT

یکی از این روش‌ها که روشی ساده و سریع برای سنجش میزان مرگ سلولی است، روش MTT است که مبنای آن تشکیل رنگ فورمازان با احیا ماده MTT (دی متیل تیازول – 2 و 5 دی فنیل تترازولیوم برمید) و یا سایر نمک‌های تترازولیوم است. با گسستگی حلقه تترازولیوم MTT توسط آنزیم‌های میتوکندریایی در سلول‌های زنده، کریستال‌های فورمازان بنفش رنگ نامحلول تشکیل می‌شود. تشکیل این کریستال‌ها نشان دهنده فعال بودن آنزیم‌های زنجیره تنفسی و معیاری برای زنده بودن سلول‌ها است. با اندازه گیری میزان جذب توسط اسپکتوفتومتر در طول موج‌های مشخص می‌توان تعداد سلول‌های زنده را تعیین کرد. درصد سلول‌های زنده یا میزان بقای سلولی، بر اساس رابطه زیر محاسبه می‌گردد:

100 × جذب متوسط نمونه‌های کنترل / جذب متوسط نمونه‌های تیمار شده = درصد سلول‌های زنده

در این آزمون تعیین پارامترهای موثر بر نتیجه بدست آمده مهم و اساسی است. این پارامترها عبارتند از:

  • رده سلولی: سالم یا سرطانی
  • تعداد سلول های کاشته شده در هر خانه از ظرف
  • زمان تیمار: در زمان های 24، 48 و 72 ساعت.
  • روش آماده سازی نمونه و استریل کردن آن

به عنوان مثال روش کار به صورت خلاصه می تواند به این صورت باشد:  در هر چاهک ظرف‌های 96 خانه، حدود 10000 سلول از رده سلولی مورد نظر را کشت داده و آن را برای 24 ساعت در انکوباتور قرار می‌دهیم. سپس سلول‌های هر خانه را با داروی مورد نظر و در غلظت مشخص تیمار می‌کنیم. 48 ساعت پس از تیمار محیط سلول‌ها را تعویض کرده و ترکیب MTT را به سلول‌ها اضافه کرده و برای 3 ساعت و در تاریکی در انکوباتور قرار می‌دهیم. سپس محیط حاوی MTT را حذف و برای حل شدن کریستال‌های فورمازان 100 میکرولیتر DMSO به هر چاهک اضافه کرده و پلیت را شیک می‌کنیم. جذب نمونه‌ها در 570 نانومتر و با رفرنس فیلتر 630 نانومترتوسط دستگاه الایزاریدر انجام شده است.

مشخصات دستگاه  آزمون MTT

تجهیزان مورد استفاده در این آزمون شامل تجهیزات کشت سلول و دستگاه الایزا ریدر می باشد. تجهیزات معمول کشت سلول به صورت زیر است:

o هود آزمایشگاهی کلاس II: دارای فیلتر لامینار در بالا و لامپ پرتو فرابنفش برای سترون کردن هود.
o انکوباتور CO2: رطوبت 95%، دمای 37 درجه سانتی گراد و دی اکسید کربن 5%.
o اتوکلاو: سترون سازی ظروف شیشه‌ای
o بن ماری: برای گرم کردن محیط کشت و باز کردن نمونه فریز شده.
o میکروسکوپ نوری invert: به‌منظور مشاهده سلول‌ها در فلاسک.
o سانتریفیوژ: جهت جداسازی سلول‌ها.

کاربردهای MTT

کاربردهای مهم این آزمون عبارتند از :

  • اندازه ­گیری تکثیر سلولی در پاسخ به عوامل گوناگون
  • تجزیه و تحلیل میزان سمیت ترکیبات کشندۀ سلول یا متوقف کنندۀ رشد سلول مانند عوامل ضد سرطان، نانوذرات، سموم، آلاینده­ های محیط زیست و …
  • ارزیابی واسطه­ های فیزیولوژیک و آنتی­بادی­ های مهار کنندۀ رشد سلولی
  •  ارزیابی زیست سازگارپذیری مواد

خدمات تفسیر MTT

نتایج به صورت آنالیز آماری و رسم نمودار ارائه خواهد شد. در صورت امکان و درخواست متقاضی محاسبه IC50 نیز انجام می شود.

0 پاسخ

پاسخ دهید

میخواهید به بحث بپیوندید؟
مشارکت رایگان.

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *